Organizm człowieka buduje ponad 200 typów komórek a każda z nich zawiera identyczny zestaw około 21 000 genów. Geny, a precyzyjniej białka kodowane przez geny umożliwiają komórce pełnienie różnorodnych funkcji. Jak to możliwe, że ten sam zestaw genów pozwala komórce mięśniowej produkować głównie białka umożliwiające skurcz i w konsekwencji ruch różnych części ciała, a w komórce nerwowej aktywne są tylko geny produkujące białka budujące system przewodzenia sygnałów elektrycznych?

Pozwalają na to epigenetyczne mechanizmy kontroli aktywności genów, które najprościej mówiąc włączają geny które są potrzebne komórce do pełnienia specyficznej funkcji, jednocześnie utrzymując geny które nie są potrzebne komórce w nieaktywnym stanie.

Początkowo epigenetyczne mechanizmy regulacji genów interesowały głównie embriologów i biologów rozwoju, gdyż sekwencyjne włączanie i wyłączanie genów jest podstawą rozwoju organizmu i umożliwia powstanie skomplikowanego wielokomórkowego organizmu z jednej komórki.

Szybko okazało się, że czynniki środowiskowe takie jak na przykład, odżywianie, aktywność fizyczna czy dym tytoniowy mogą wpływać na funkcjonowanie epigenetycznych mechanizmów kontroli aktywności genów. Zakłócenie prawidłowego funkcjonowania tych mechanizmów prowadzi do stanu, w którym w komórce aktywne są geny które nie są komórce potrzebne, a geny czasem krytyczne do prawidłowego funkcjonowania komórki są wyłączone. Komórka taka nie funkcjonuje prawidłowo i może przekształcić się w komórkę nowotworową.

Po latach badań możemy w stosukowo łatwy sposób zbadać, które geny zostały rozregulowane, „zepsute” przez zakłócone mechanizmy epigenetyczne. To daje nam możliwość wykrycia komórek ze zmianami epigenetycznymi, zanim jeszcze doprowadzą one do zawansowanego procesu nowotworowego. Epigenetyczne zmiany aktywności genów są odwracalne, w przeciwieństwie do mutacji genetycznych, które tak samo jak zmiany epigenetyczne zakłócają normalną funkcję genu, ale nie jesteśmy jeszcze w stanie ich efektywnie naprawiać. To otwiera możliwość opracowania nowych metod terapeutycznych które pozwolą przywrócić prawidłową aktywność rozregulowanych genów i odwrócić proces chorobowy. Co więcej nie tylko leczeniem możemy odwrócić niekorzystne zmiany epigenetyczne. Zmiany w stylu życia takie jak zbilansowana dieta czy aktywność fizyczna mogą tak samo skutecznie jak leczenie, odwrócić niekorzystne zmiany epigenetyczne.

Profesor Timothy Bestor w latach dziewięćdziesiątych ubiegłego wieku na konferencji naukowej Gordon Research Conference zaproponował następującą definicję epigenetyki:

„Gdy znamy gen i jego produkt: zajmujemy się biologią molekularna;
znamy gen i nie znamy jego produktu: zajmujemy się genetyka;
nie znamy genu, znamy jego produkt: zajmujemy się biochemią;
nie znamy genu, nie znamy jego produktu: zajmujemy się epigenetyką” [1].

Powyższa definicja w swej prostocie zawiera istotę prawdy na temat dynamicznej dziedziny nauki jaką jest epigenetyka, w której to odkrycia badań podstawowych w stosunkowo krótkim czasie udało się wprowadzić do praktyki klinicznej. A cytując definicje: Epigenetyka jest nauką zajmującą się dziedzicznymi mechanizmami ekspresji genów, które nie są zależne od zmian w sekwencji DNA. Konsekwentnie, mechanizmy epigenetyczne regulują ekspresję genów i pozwalają na to by komórki z identycznym materiałem genetycznym pełniły różnorodne funkcje w organizmie.

1. Gen i jego produkt

Gen to fragment DNA zawierający informacje o budowie białka. Ta informacja zapisana jest w sekwencji nukleotydów (cegiełek) budujących DNA a to czy jest czytana i białko powstaje jest kontrolowane przez promotor genu (Grafika 1). Promotor to sekwencja DNA, najczęściej na początku genu i to z promotora genu inicjowany jest proces czytania informacji zapisanej w genie, który kończy się syntezą białka.

Epigenetyka (1)

Grafika 1. Schematyczne przedstawienie genu i promotora.

2.2 Inicjacja proces czytania genów

Inicjacja procesu czytania genu wymaga przyłączenia to promotora szeregu białek zwanych czynnikami transkrypcyjnymi i tylko po ich przyłączeniu polimeraza DNA może rozpocząć czytanie genu. Tak więc, jakakolwiek modyfikacja sekwencji promotora będzie skutkowała zablokowaniem możliwości łączenia się czynników transkrypcyjnych do promotora i blokadę procesu czytania genu [2].

2.3. Modyfikacje DNA

Pierwszą odkrytą modyfikacją promotora blokująca proces czytania genu była metylacja. Metylacja DNA to enzymatyczne przełączenie grup metylowych (-CH3) do DNA. U ludzi metylacji prawie zawsze podlega cytozyna w obrębie dwunuklotydu 5′-CpG-3′ [3] i ponad 60% promotorów genów kodujących białka zawiera wysokie ilości tych sekwencji,  co daje możliwość kontrolowania tych genów przez proces metylacji promotora (Grafika 2).

Epigenetyka (2)

Grafika 2: Gen bez metylacji w obrębie promotora jest czytany (panel A) podczas gdy przyłączenie grup metylowych (czerwone lollipops) skutkuje blokadą dostępu czynników transkrypcyjnych do promotora i blokadą procesu czytania genu.

2.3. Metylacja DNA jest procesem odwracalnym

Enzymy katalizujące proces metylacji DNA to metylotransferazy DNA (ang. DNA metyltransferazes – DNMTs)  [4]. Ponieważ metylacja DNA jest procesem enzymatycznym i dlatego odwracalnym, w przeciwieństwie do mutacji, która trwale dezaktywuje gen, usuniecie metylacji z promotora genu przywraca jego funkcję. Grupy metylowe można usunąć z DNA na dwa sposoby: pasywnie i aktywnie. Bierna demetylacja występuje, gdy grupy metylowe nie są syntezowane w nowo replikowanym DNA i wraz z powtarzającymi się cyklami podziału komórki metylacja zmniejsza się. Natomiast aktywna demetylacja wymaga udziału enzymów, które usuwają grupy metylowe. Możliwość usuwania metylacji jest szczególnie ważna w kontekście leczenia chorób u podłoża których leżą zmiany metylacji ponieważ otwiera możliwość skutecznej terapii która ma na celu przywrócenie funkcji genów deaktywowanych przez metylację.

 2.4. Metylacja w zdrowej i chorej komórce

Podczas normalnego rozwoju organizmu regulacja genów przez metylację DNA ma kluczowe znaczenie  [5, 6]. Inaktywacja chromosomu X i imprinting rodzicielski (zależne od metylacji ograniczenie ekspresji genu do allelu ojcowskiego lub matczynego) są klasycznymi przykładami procesów gdzie metylacja odgrywa kluczową rolę [7]. Jednocześnie zmiany metylacji genów takie jak dezaktywacja genów które powinny być aktywne i aktywacja genów które nie powinny działać w specyficznych komórkach są jednym z podstawowych procesów w procesie chorobowym.  Transformacja nowotworowa była pierwszym patologicznym procesem, w którym zidentyfikowano zmiany metylacji. Zmiany te obejmowały globalną utratę metylacji genomu neoplastycznej komórki [8, 9] oraz metylację promotorów genów takich jak geny supresorowe które mają na celu kontrolowanie komórki przed przejściem w komórkę nowotworową [10].

Pierwszym odkrytym genem supresorowym inaktywowanym przez metylację był gen RG w siatkówczaku (typ nowotworu złośliwego oka)  [11, 12], a metylcja promotora tego genu niemalże całkowicie blokowała jego aktywność [13]. Dotychczas w literaturze opisano setki genów, których aktywność jest zakłócana przez metylację promotora podczas transformacji nowotworowej a zmiany metylacji na równi z mutacjami, uznane zostały za integralną część procesu nowotworowego.

 2.5. Inne mechanizmy epigenetycznej regulacji genów

Metylacja DNA jest tylko jednym z epigenetycznych mechanizmów regulacji ekspresji genów. Proces czytania genów może być regulowany przez modyfikacje histonów, białka regulujące architekturę jądra komórkowego np. elementy kompleksu SWI/SNF [14] czy niekodujące RNA (non-coding RNA) [15, 16].

Niemniej jednak wszystkie poziomy epigenetycznej regulacji aktywności genów są zintegrowane i współdziałają razem by odpowiednie geny były włączone w odpowiednim czasie i miejscu, co zapewnia specyficzną funkcję komórki w organizmie.

3. Metylacja jako biomarker stosowany w diagnostyce i leczeniu

Biomarker w medycynie jest określany jako wskaźnik stanu biologicznego lub klinicznego, który można zmierzyć. W przypadku gdy zmiana metylacji deaktywuje gen co skutkuje zaburzeniem normalnej funkcji komórki, ta zmiana spełnia warunek definicji biomarkera specyficznego stanu komórki. Zmiany metylacji promotora genu MGMT były jednym z pierwszych opisanych biomarkerów metylacyjnych. Białko kodowane przez ten gen to metylotransferazy O6-metyloguaniny (MGMT) która odgrywa kluczową funkcję w usuwaniu zmian w DNA powodowanych przez leki alkalizujące takie jak temozolomid, wykorzystywanych w chemioterapii [17-19].  Metylacja promotora genu MGMT deaktywuje gen [20], skutkiem czego komórki nowotworu z metylowanym MGMT nie produkują białka MGMT i nie potrafią reperować zmian w DNA indukowanych przez leki alkalizujące co prowadzi to ich smierci [21]. Po raz pierwszy związek między lekami alkalizującymi a matylacją genu MGMT zauważone u pacjentów z podtypem glejaka.  Pacjenci, u których stwierdzono metylacje MGMT w komórkach nowotworu, okazali się mieć statystyczne istotnie dłuższą przeżywalność po leczeniu temozolomidem niż pacjenci, u których metylacji tego genu nie stwierdzono [22]. Obecnie badanie metylacji genu MGMT staje się częścią diagnostyki, gdzie szczególnie u pacjentów zawansowanym wieku i słabych a decyzja o leczeniu temozolomidem opierana jest o wynik testu na metylację genu MGMT.

4. Zastosowanie zmian metylacji w praktyce klinicznej

Z klinicznego punktu widzenia biomarkery mogą być wykorzystane do:
4.1. oceny ryzyka wystąpienia choroby u osób zdrowych,
4.2. wczesnego wykrywanie choroby,
4.3. wyboru właściwego leczenia (personalizacja leczenia),
4.4. monitorowanie nawrotów choroby.

Po latach badań wiemy, że biomarkery metylacji można wykorzystać na każdym z powyższych etapów postępowania klinicznego, ale zastosowanie tych biomarkerów w klinikach jest wciąż marginalne. Niemniej jednak wraz z znaczącym postępem technologiczny w metodach wykrywania metylacji wydaje się, że nadszedł czas na wdrożenie analizy biomarkerów metylacji do rutynowej praktyki klinicznej, co najlepiej obrazuje rosnąca liczba tego typu testów diagnostycznych zatwierdzonych do użytku klinicznego przez FDA (ang. USA Food and Drug Administration Agency)  [23-25].

4.1. Biomarkery oceny ryzyka choroby

Ten typ biomarkerów służy do oceny prawdopodobieństwa wystąpienia u zdrowej osoby konkretnej choroby. Wiele badań pokazuje, że ekspozycja na czynniki środowiskowe indukuje zmiany w metylacji DNA. Na przykład, palenie tytoniu powiązane zostało ze zmianami metylacji nie tylko w komórkach krwi palaczy [26] ale również dzieci matek palących w czasie ciąży [27]. Czy, metylacja genu BRCA1 w komórkach krwi powiązana jest z zwiększonym ryzykiem raka piersi [28]. Dlatego też zastosowanie zmian metylacyjnych do oceny ryzyka w epidemiologii jest oczywiste.

4.2. Biomarkery pomocne we wczesnym wykrywaniu choroby

Wczesne wykrycie choroby drastycznie znacznie zwiększa szansę na wyleczenie. Z badań nad karcynogenezą specyficznych nowotworów jednoznacznie wynika, że zmiany metylacji zachodzą na jej wczesnych etapach, jeśli nie inicjują transformację nowotworową [29-31] więc zmiany te mogą być wykorzystane do wczesnego wykrywania choroby. Szczególnie że DNA z nowotworu jest uwalniane i może być łatwo wykryte w płynach ustrojowych (określanych jako płynne biopsje ang. liquid biopsies), które mają bezpośredni kontakt z tkanką nowotworową, tj. osocze lub plwocina u pacjentów z rakiem płuca. Wykrywanie specyficznych dla różnych typów nowotworów zmian metylacji w płynnych biopsjach w najbliższym czasie może zrewolucjonizować wczesną diagnostykę nie tylko nowotworów, ale i innych chorób. Głównie dzięki temu że testy diagnostyczne oparte na płynnych biopsjach są praktycznie nieinwazyjne i łatwe do przeprowadzenia. Dwa testy diagnostyczne wykrywające zmiany metylacji w DNA uwolnionym z guza do płynnych biopsji już zostały zatwierdzone przez Food and Drug Administration (FDA) do użycia we wczesnej diagnostyce raka jelita grubego [23, 25].

4.3. Biomarkery stosowane w leczeniu choroby

Kliniczny cechy nowotworu zależą w dużej mierze od specyficznych zmian metylacji, które zostały nabyte przez komórki nowotworowe podczas procesu karcynogenezy. W związku z tym, zmiany metylacji, charakterystyczne dla poszczególnych nowotworów, mogą być wykorzystane jako biomarkery w procesie leczenia, gdyż rodzaj tych zmian może przewidywać np. agresywność choroby czy odporność na leczenie. Badanie methylacji genu MGMT w glejaku [32] jest pierwszym przykładam biomarkera metylacji używanego do personalizacji leczenia. W literaturze naukowej opisane są setki genów, których zmiany metylacji zostały powiązane z cechami klinicznym choroby a badania nad oceną klinicznej użyteczności testów na metylację tych genów, prowadzone są w większości ośrodków naukowych na całym świecie.

4.4. Biomarkery monitorowania/kontrolne po zakończeniu leczenia

Wraz z postępem w leczeniu i rosnącą liczbą terapii coraz więcej chorób nowotworowych (i innych chorób) staje się chorobami przewlekłymi które można kontrolować przy jednoczesnym minimalnym efekcie na styl życia pacjenta. U pacjentów chronicznie chorych ważne staje się wczesne wykrywanie nawrotów choroby. Dlatego też wzrasta zapotrzebowanie na opracowanie biomarkerów umożliwiających wcześniejszą identyfikację pacjentów z nawrotem choroby. Biomarkerów opisanych w punkcie 4.2. mogą być również wykorzystane do wykrywania nawrotów choroby. Testy oparte na biomarkerach metylacyjnych używane do diagnostyki nawrotów choroby są już w zaawansowanym stadium walidacji w przebiegu raka jelita grubego [24, 33]. Co pokazuje, że zmiany metylacji mogą również być zastosowane jako biomarkery na tym etapie klinicznej opieki nad pacjentem.

Tomasz K Wojdacz
Dr.n.med, MSc. Associate profesor,
Kierownik Pracowni Epigentyki Klinicznej
Pomorski Uniwersytet Medyczny
Unii Lubelskiej 1,
70-001 Szczecin

Refencje:

  1. Zilberman D, Henikoff S: Epigenetic inheritance in Arabidopsis: selective silence. Curr Opin Genet Dev 2005, 15(5):557-562.
  2. Watt F, Molloy PL: Cytosine methylation prevents binding to DNA of a HeLa cell transcription factor required for optimal expression of the adenovirus major late promoter. Genes Dev 1988, 2(9):1136-1143.
  3. Ehrlich M, Gama-Sosa MA, Huang LH, Midgett RM, Kuo KC, McCune RA, Gehrke C: Amount and distribution of 5-methylcytosine in human DNA from different types of tissues of cells. Nucleic Acids Res 1982, 10(8):2709-2721.
  4. Bestor TH: The DNA methyltransferases of mammals. Hum Mol Genet 2000, 9(16):2395-2402.
  5. Borgel J, Guibert S, Li Y, Chiba H, Schubeler D, Sasaki H, Forne T, Weber M: Targets and dynamics of promoter DNA methylation during early mouse development. Nat Genet 2010, 42(12):1093-1100.
  6. Smith ZD, Meissner A: DNA methylation: roles in mammalian development. Nat Rev Genet 2013, 14(3):204-220.
  7. Bird A: DNA methylation patterns and epigenetic memory. Genes Dev 2002, 16(1):6-21.
  8. Feinberg AP, Vogelstein B: Hypomethylation distinguishes genes of some human cancers from their normal counterparts. Nature 1983, 301(5895):89-92.
  9. Gama-Sosa MA, Slagel VA, Trewyn RW, Oxenhandler R, Kuo KC, Gehrke CW, Ehrlich M: The 5-methylcytosine content of DNA from human tumors. Nucleic Acids Res 1983, 11(19):6883-6894.
  10. Baylin SB, Hoppener JW, de Bustros A, Steenbergh PH, Lips CJ, Nelkin BD: DNA methylation patterns of the calcitonin gene in human lung cancers and lymphomas. Cancer Res 1986, 46(6):2917-2922.
  11. Greger V, Passarge E, Hopping W, Messmer E, Horsthemke B: Epigenetic changes may contribute to the formation and spontaneous regression of retinoblastoma. Hum Genet 1989, 83(2):155-158.
  12. Sakai T, Toguchida J, Ohtani N, Yandell DW, Rapaport JM, Dryja TP: Allele-specific hypermethylation of the retinoblastoma tumor-suppressor gene. Am J Hum Genet 1991, 48(5):880-888.
  13. Ohtani-Fujita N, Fujita T, Aoike A, Osifchin NE, Robbins PD, Sakai T: CpG methylation inactivates the promoter activity of the human retinoblastoma tumor-suppressor gene. Oncogene 1993, 8(4):1063-1067.
  14. Zhang P, Torres K, Liu X, Liu CG, Pollock RE: An Overview of Chromatin-Regulating Proteins in Cells. Curr Protein Pept Sci 2016, 17(5):401-410.
  15. Holoch D, Moazed D: RNA-mediated epigenetic regulation of gene expression. Nat Rev Genet 2015, 16(2):71-84.
  16. Lujambio A, Lowe SW: The microcosmos of cancer. Nature 2012, 482(7385):347-355.
  17. Foote RS, Mitra S, Pal BC: Demethylation of O6-methylguanine in a synthetic DNA polymer by an inducible activity in Escherichia coli. Biochem Biophys Res Commun 1980, 97(2):654-659.
  18. Olsson M, Lindahl T: Repair of alkylated DNA in Escherichia coli. Methyl group transfer from O6-methylguanine to a protein cysteine residue. J Biol Chem 1980, 255(22):10569-10571.
  19. Pegg AE: Mammalian O6-alkylguanine-DNA alkyltransferase: regulation and importance in response to alkylating carcinogenic and therapeutic agents. Cancer Res 1990, 50(19):6119-6129.
  20. Qian XC, Brent TP: Methylation hot spots in the 5′ flanking region denote silencing of the O6-methylguanine-DNA methyltransferase gene. Cancer Res 1997, 57(17):3672-3677.
  21. Esteller M, Garcia-Foncillas J, Andion E, Goodman SN, Hidalgo OF, Vanaclocha V, Baylin SB, Herman JG: Inactivation of the DNA-repair gene MGMT and the clinical response of gliomas to alkylating agents. N Engl J Med 2000, 343(19):1350-1354.
  22. Hegi ME, Diserens AC, Gorlia T, Hamou MF, de Tribolet N, Weller M, Kros JM, Hainfellner JA, Mason W, Mariani L et al: MGMT gene silencing and benefit from temozolomide in glioblastoma. N Engl J Med 2005, 352(10):997-1003.
  23. Nian J, Sun X, Ming S, Yan C, Ma Y, Feng Y, Yang L, Yu M, Zhang G, Wang X: Diagnostic Accuracy of Methylated SEPT9 for Blood-based Colorectal Cancer Detection: A Systematic Review and Meta-Analysis. Clin Transl Gastroenterol 2017, 8(1):e216.
  24. Young GP, Pedersen SK, Mansfield S, Murray DH, Baker RT, Rabbitt P, Byrne S, Bambacas L, Hollington P, Symonds EL: A cross-sectional study comparing a blood test for methylated BCAT1 and IKZF1 tumor-derived DNA with CEA for detection of recurrent colorectal cancer. Cancer Med 2016, 5(10):2763-2772.
  25. Imperiale TF, Ransohoff DF, Itzkowitz SH, Levin TR, Lavin P, Lidgard GP, Ahlquist DA, Berger BM: Multitarget stool DNA testing for colorectal-cancer screening. N Engl J Med 2014, 370(14):1287-1297.
  26. Sayols-Baixeras S, Lluis-Ganella C, Subirana I, Salas LA, Vilahur N, Corella D, Munoz D, Segura A, Jimenez-Conde J, Moran S et al: Identification of a new locus and validation of previously reported loci showing differential methylation associated with smoking. The REGICOR study. Epigenetics 2015, 10(12):1156-1165.
  27. Joubert BR, Felix JF, Yousefi P, Bakulski KM, Just AC, Breton C, Reese SE, Markunas CA, Richmond RC, Xu CJ et al: DNA Methylation in Newborns and Maternal Smoking in Pregnancy: Genome-wide Consortium Meta-analysis. Am J Hum Genet 2016, 98(4):680-696.
  28. Snell C, Krypuy M, Wong EM, kConFab i, Loughrey MB, Dobrovic A: BRCA1 promoter methylation in peripheral blood DNA of mutation negative familial breast cancer patients with a BRCA1 tumour phenotype. Breast Cancer Res 2008, 10(1):R12.
  29. Nuovo GJ, Plaia TW, Belinsky SA, Baylin SB, Herman JG: In situ detection of the hypermethylation-induced inactivation of the p16 gene as an early event in oncogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A 1999, 96(22):12754-12759.
  30. Mittag F, Kuester D, Vieth M, Peters B, Stolte B, Roessner A, Schneider-Stock R: DAPK promotor methylation is an early event in colorectal carcinogenesis. Cancer Lett 2006, 240(1):69-75.
  31. Belinsky SA, Nikula KJ, Palmisano WA, Michels R, Saccomanno G, Gabrielson E, Baylin SB, Herman JG: Aberrant methylation of p16(INK4a) is an early event in lung cancer and a potential biomarker for early diagnosis. Proc Natl Acad Sci U S A 1998, 95(20):11891-11896.
  32. Mansouri A, Hachem LD, Mansouri S, Nassiri F, Laperriere NJ, Xia D, Lindeman NI, Wen PY, Chakravarti A, Mehta MP et al: MGMT promoter methylation status testing to guide therapy for glioblastoma: refining the approach based on emerging evidence and current challenges. Neuro Oncol 2018.
  33. Murray DH, Baker RT, Gaur S, Young GP, Pedersen SK: Validation of a Circulating Tumor-Derived DNA Blood Test for Detection of Methylated „BCAT1 and „IKZF1” DNA. The Journal of Applied Laboratory Medicine: An AACC Publication 2017, 2:165-175.